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免疫熒光染色實驗中染料需具備條件說明
點擊次數(shù):346 更新時間:2024-05-11

  免疫熒光的原理

免疫熒光(Immunofluorescence,IF)原理免疫熒光技術(shù)是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。它是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光基團,再用這種熒光抗體(或抗原)作為探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體)。利用熒光顯微鏡可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織,從而確定抗原或抗體的性質(zhì)和定位,以及利用定量技術(shù)(比如流式細(xì)胞儀)測定含量。

紫外光激發(fā)熒光物質(zhì)放射熒光示意圖免疫熒光實驗的主要步驟包括細(xì)胞片制備、固定及通透(或稱為透化)、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細(xì)胞片制備(通俗的說法是細(xì)胞爬片)是免疫熒光實驗的第一步,細(xì)胞片的質(zhì)量對實驗的成敗至關(guān)重要,原因很簡單,如果發(fā)生細(xì)胞掉片,一切都無從談起。這一步關(guān)鍵的是玻片(SlidesorCoverslips)的處理以及細(xì)胞的活力,有人根據(jù)成功經(jīng)驗總結(jié)出許多有益的細(xì)節(jié)或小竅門,非常值得借鑒。

固定和通透步驟最重要的是根據(jù)所研究抗原的性質(zhì)選擇適當(dāng)?shù)墓潭ǚ椒ǎ线m的固定劑和固定程序?qū)τ讷@得好的實驗結(jié)果是非常重要的。免疫熒光中的封閉和抗體孵育與其它方法(如ELISA或WesternBlot)中的相同步驟是類似的,最重要的區(qū)別在于免疫熒光實驗中要用到熒光抗體,因此必須謹(jǐn)記避光操作,此外抗體濃度的選擇可能更加關(guān)鍵。最后需要注意的是,標(biāo)記好熒光的細(xì)胞片應(yīng)盡早觀察,或者用封片劑封片后在4℃或-20℃避光保存,以免因標(biāo)記蛋白解離或熒光減弱而影響。

  用于免疫熒光染色的染料需具備以下幾個條件:

熒光染料應(yīng)有較高的量子產(chǎn)額和消光系數(shù);

熒光染料對488nm的激發(fā)光波長有較強的吸收;

發(fā)射光波長與激發(fā)光波長之間應(yīng)有較大的波長差;

容易與被標(biāo)記的單克隆抗體結(jié)合而不影響抗體自身的特異性。

1.異硫氰酸熒光素(FITC):可產(chǎn)生亮綠色熒光。FITC是免疫熒光標(biāo)記最chang用的熒光探針。

2.德州紅:與生wu素偶聯(lián)的抗體有很強的親和力,產(chǎn)生紅色熒光。

3.藻膽蛋白類:主要包括藻紅蛋白(PE)、藻青蛋白(PC)、別藻青蛋白(APC)三類。多發(fā)生橙色至紅色熒光。

4.能量傳遞復(fù)合染料

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